Розділ 2

Вірусологія — наука про віруси та явища, які вони зумовлюють. Народилась вірусологія у надрах мікробіології і тому до недавнього часу збудники вірусних хвороб людини й тварин були предметом вивчення мікробіології. Проте, як було встановлено пізніше, віруси не є організмами (мікроорганізмами). Вони не мають власної білок-синтезувальної системи, притаманної всім відомим організмам, а тому не можуть самостійно існувати. Віруси — абсолютні внутрішньоклітинні паразити, паразити на генетичному рівні.
Основними ознаками вірусів, що відрізняють їх від відомих мікроорганізмів, зокрема бактерій, є:
віруси — надзвичайно дрібні істоти. Розмір вірусів коливається в межах 18 – 300 нм, тобто вони у сотні разів менші за бактерії, завдяки чому фільтруються крізь бактерійні фільтри (звідси назва — «фільтрівний вірус»);
віруси не мають клітинної будови (у них відсутні ядро, цитоплазма та ін.);
віруси не ростуть на штучних живильних середовищах (відсутність власної білоксинтезувальної системи позбавляє їх принципової можливості розмножуватись на авітальних середовищах);
віруси містять лише одну нуклеїнову кислоту — ДНК або РНК;
у вірусів відсутні процеси асиміляції та дисиміляції;
віруси є абсолютними внутрішньоклітинними паразитами (здатні розмножуватись лише у живих клітинах).
Для вірусів характерні дві форми існування: внутрішньоклітинна (комплекс вірус — клітина) та позаклітинна, яка є неактивною.
Морфологія вірусів. Прототипом бактерійної клітини є віріон (вірусна частинка). Віріони у різних видів вірусів можуть бути різними, морфологічно абсолютно не схожими або ідентичними. Вони можуть бути круглими (кулястими), ниткоподібними, невизначеної форми (поліморфні) тощо. За розміром віріонів віруси поділяють на дрібні (18 – 50 нм), середні (50 – 100 нм) і великі (понад 100 нм).
Віріон складається з нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), білка (просто побудовані віруси-нуклеокапсиди) і можуть містити ліпіди й вуглеводи (складні віруси).
У центрі віріона розміщена нуклеїнова кислота, яка оточена білковою оболонкою — капсидом. Оболонка побудована з капсомерів, кількість яких у різних вірусів неоднакова і становить від 32 до 1000 і більше. Капсомери можуть бути сформовані у капсиди за двома принципами: за кубічною або спіралеподібною симетріями. Сформовані за кубічною симетрією віріони мають, як правило, вигляд ікосаедрів — двадцятигранників (з трикутними площинами). Віріони деяких вірусів крім капсиду оточені ще й суперкапсидною мембраною, що містить білки, ліпіди та іноді вуглеводи. На поверхні суперкапсиду є пепломери паличко-, булавоподібної чи іншої форми.
Репродукція вірусів — складний процес. Вона можлива лише у «чутливих» до певного вірусу клітинах. Щоб розмножитись, вірус повинен проникнути у клітину, що можливо за наявності відповідних рецепторів на її поверхні, позбавитись оболонок з тим, щоб вивільнити власний генетичний апарат (нуклеїнову кислоту), який і забезпечить подальший синтез необхідних (вірусоспецифічних) компонентів. При цьому використовуються клітинні ресурси, зокрема амінокислоти, нуклеотиди, енергія і клітинні механізми синтезу білка (рибосоми, ферменти). Вірус, як абсолютний паразит на генетичному рівні, має мінімум власних компонентів, необхідних для відтворення, і «приносить» у клітину лише ті, яких у ній немає. Наприклад, вірус лейкозу великої рогатої худоби має фермент зворотну транскриптазу, або ревертазу. Такий фермент у клітинах не трапляється, а без нього неможливо реалізувати генетичну інформацію, закодовану в РНК збудника.
Репродукція більшості вірусів відбувається надзвичайно інтенсивно. Вже через 8 – 12 год після проникнення може з’явитись по-томство — сотні й тисячі нових віріонів. Клітина при цьому «виснажується» і, як правило, гине. Загибель клітин і є основним елементом хвороботворного процесу, зумовленого патогеном вірусної природи.
Вірус, що проник у клітину і депротеїнізувався, неможливо розпізнати жодним чином. Сформовані ж великі віруси, наприклад вірус віспи, можна побачити за допомогою звичайного світлового мікроскопа (елементарні тільця). Окремі види вірусів здатні зумовлювати утворення в уражених клітинах своєрідних структур — вірусних тілець-включень, які є накопиченням віріонів, або ж віріонів і клітинного зміненого матеріалу. Вони можуть знаходитись у ядрі (ядерні тільця-включення) або в цитоплазмі (цитоплазматичні тільця-включення). Виявлення вірусних тілець-включень має діагностичне значення (наприклад, тілець Бабеша — Негрі під час діагностики сказу).
Середні та дрібні віруси можна роздивитись лише за допомогою електронного мікроскопа. В електронному мікроскопі використовуються не світлові промені, як у звичайному, а потік електронів, що забезпечує високу його роздільну здатність, яка сягає 1 Å (світлові мікроскопи забезпечують роздільну здатність 150 – 200 нм). Інакше кажучи, електронний мікроскоп порівняно зі звичайним світловим «бачить» у 1500 – 2000 разів менші об’єкти.
Вірусологія має дещо відмінні від мікробіологічних методи досліджень, що пов’язано з особливостями вірусів. У зв’язку з тим, що віруси — внутрішньоклітинні паразити, досліджуваний матеріал доводиться піддавати обробці, яка забезпечує вивільнення внутрішньоклітинних віріонів, позбавлення від клітинного детриту, сторонніх домішок. Цього можна досягти різними методами, зокрема фільтруванням крізь бактерійні фільтри (пропускають лише віруси), методом ультрацентрифугування та ін.
Ультрацентрифугування — центрифугування за допомогою швидкісних ультрацентрифуг. Ротор цих апаратів обертається зі швидкістю, яка в десятки разів перевищує кількість обертів ротора у звичайних центрифугах, що забезпечує осадження таких дрібних корпускул, як віріони. Ізоляція віріонів зветься очищенням вірусів. Під час очищення зазвичай підвищують і концентрацію вірусу, що є надзвичайно важливим, оскільки забезпечує його виявлення спеціальними методами. Очищення та концентрування вірусів здійснюють, як правило, в єдиному процесі. У кожному конкретному випадку, зважаючи на характеристику вірусу, мету та умови, використовують той чи інший з численних розроблених метод.
Культивування вірусів. Основною метою культивування вірусів в умовах лабораторії є потреба розмноження збудника з тим, що розпізнати його за допомогою різних методів. Крім того, культивування здійснюється в разі отримання вірусного матеріалу, необхідного для створення діагностиків, вакцин тощо. Культивування вірусів можливе на чутливих лабораторних тваринах, пташиних ембріонах, що розвиваються, або у клітинних культурах. Останнім часом перевагу віддають клітинним культурам.
Клітинна культура (КК) — це ріст клітин поза межами живого організму, в пробірці, скляному флаконі (мантрасі) чи флаконі з пластику. Клітини отримують з тканин, узятих переважно від ембріонів тварин, за спеціальними методиками, вміщують (висівають) у відповідний посуд, вносять у нього живильне середовище, що містить вільні амінокислоти, вітаміни, мінеральні речовини, і вміщують у термостат. За наявності оптимальних умов клітини діляться, утворюючи суцільний шар (моношар, моношарова клітинна культура). Це спостерігається приблизно через 2 – 4 доби після посіву.
Клітинні культури, отримані з матеріалу, взятого безпосередньо від тварин, називають первинними. Первинні КК можна пересівати (пасажувати) 3 – 6 разів, потім вони втрачають можливість розмножуватись і гинуть. Дослідникам вдалося створити умови, за яких окремі клітини набули здатності пересіватися практично безкінечно. Відповідні КК дістали назву перещеплюваних (постійні лінії клітин). Нині їх десятки. З ними зручніше маніпулювати, вони досить добре вивчені, визначено їхню чутливість до різних вірусів, завдяки чому такі КК набули широкого застосування у вірусологічних лабораторіях. Створено банки перещеплюваних клітинних культур. Клітинні культури зберігаються в замороженому стані роками і в разі потреби надсилаються користувачам.
Крім моношарових існують також суспензійні КК. У цьому випадку клітини вільно знаходяться у рідкому середовищі і в умовах постійного перемішування не прилипають до скла. Такі культури частіше використовують у біологічній промисловості, під час виготовлення біопрепаратів. Розроблено й інші модифікації (наприклад, ролерне культивування), які забезпечують вищу «врожайність» вірусу порівняно зі стаціонарним культивуванням. Розроблено також методики отримання диплоїдних клітинних культур. Ці КК культивують в умовах, які стабільно забезпечують вихідний «нормальний» каріотип клітин, що виключає небезпеку можливої канцерогенної їх дії після введення в організм препаратів, отриманих з їх використанням.
Зараження клітинних культур здійснюється за спеціально розробленими методиками. Заражені КК інкубують у термостаті та щодня мікроскопують моношар клітин, відмічаючи можливі зміни порівняно з незараженими (контрольними) зразками. Багато вірусів через кілька діб після зараження зумовлюють морфологічні зміни в моношарі клітин — від ледь помітних до повного руйнування моношару. Такі віруси (штами) називають цитопатогенними, а їхню дію, відповідно, цитопатогенною (ЦПД). Морфологічні зміни ж у моношарі називають цитопатичним ефектом (ЦПЕ). При первинному виділенні збудника ЦПД часто не виявляється. У такому випадку здійснюють 2 – 3 «сліпих» пасажі. Є також віруси, які не зумовлюють ЦПЕ, їх називають нецитопатогенними вірусами (штамами). Виявлення нецитопатогенних вірусів здійснюється різними методами, що ґрунтуються на використанні різних варіантів імунної реакції. Останні використовуються також для ідентифікації (розпізнавання виду) вірусів. З цією метою значного поширення набули реакція нейтралізації вірусу (РН), реакція імуноферментного аналізу (ІФА), реакція імунофлуоресценції (РІФ), реакція зв’язування комплементу (РЗК) та ін., а також молекулярно-генетичні методи (полімеразна ланцюгова реакція — ПЛР).
Патогенна дія вірусів на організм тварини пов’язана з ушкодженням чутливих клітин, що супроводжується місцевою та загальною реакціями. У місці розмноження спостерігається руйнування клітин (наприклад, десквамація епітелію, утворення везикул на слизовій оболонці чи шкірі, деструкція ділянок головного мозку тощо). Як правило, вірус спочатку розмножується в місці проникнення (ворота інфекції), потім поширюється з кров’ю, лімфою нервовими волокнами чи іншим шляхом по всьому організму, досягає найчутливіших до нього клітин, де і накопичується у найбільшій концентрації. У зв’язку з цим розрізняють епітеліотропні, нейротропні, антропні, ентеротропні та пневмотропні віруси.
Тропізм вірусів — важливий фактор у реалізації їхніх патогенних потенцій. Залежно від інтенсивності руйнування клітин, локалізації накопичення вірусу спостерігаються ті чи інші прояви клініки і тяжкість перебігу хвороби та її закінчення. Поява вірусу в крові (віремія) супроводжується пропасницею, ураженням головного мозку — парезами й паралічами і т.д.
Є віруси, які зумовлюють розвиток пухлинних хвороб. Уражені ними клітини не гинуть, а діляться, не досягнувши фізіологічної зрілості. Це, зокрема, ретровіруси — збудники лейкозу великої рогатої худоби та інших видів тварин.
Вірусні інфекції досить часто супроводжуються ускладненнями, спричиненими іншими патогенам, зокрема бактеріями, грибами чи найпростішими, що зумовлено передусім порушенням відповідних природних бар’єрів.
Чимало вірусних інфекцій мають латентний перебіг. Так, досить поширені серед великої рогатої худоби пестивіруси, а серед людей — герпес-віруси лише зрідка зумовлюють процес, що супроводжується клінічними ознаками. Латентне вірусоносійство надзвичайно поширене серед популяцій різних видів тварин. Перехід латентної інфекції в явну відбувається при послабленні імунного захисту організму тварин. Знання основних елементів, що забезпечують несприйнятливість організму до вірусів, — надзвичайно важливий компонент у формуванні кваліфікованого спеціаліста ветеринарної медицини.
Генетика вірусів. Вірусам, як і всім іншим живим істотам, притаманні спадковість та мінливість. Віруси мають унікальний геном, який може бути представлений ДНК або РНК. Геном детермінує синтез необхідних вірусу компонентів, забезпечуючи тактику його «поведінки» в зараженій клітині. Завдяки генетичному контролю потомство вірусу відповідає характеристиці батьківського, тобто заново репродукований вірус ящуру залишається вірусом ящуру з тими самими ознаками, що й попередній. Разом з тим збереження виду без наявності можливості змінюватись не дало б змоги вірусам існувати як видам у динамічному для них середовищі.
Вірусам, як і всім іншим живим істотам, притаманна генотипова та фенотипова мінливість. Механізм мінливості розшифрований. У його основі лежать мутації та рекомбінації. Мутації спричинюються різними чинниками і призводять до змін у ланцюзі нуклеїнової кислоти — вірусного геному. Від місця (локусу), де відбулася зміна, залежать спричинені нею результати існування (виживання чи загибель) вірусу.
Рекомбінації — обмін генетичним матеріалом поміж спорідненими вірусами (штамами) надзвичайно поширене у природі явище. Завдяки їм з’являються штами з новими властивостями, що і пояснює поліморфізм багатьох збудників вірусних хвороб, які циркулюють у природі.
Лабораторна діагностика вірусних хвороб. Діагностика вірусних хвороб, як і захворювань бактерійної природи, здійснюється комплексно. За результатами клінічного огляду, даних патологоанатомічного розтину, аналізу епізоотологічного обстеження установлюють, як правило, попередній діагноз і направляють відповідний матеріал для вірусологічного дослідження в лабораторію. Важливо, щоб матеріал був відібраний з урахуванням патогенезу хвороби, правильно запакований (законсервований) та доставлений у лабораторії згідно з чинними відповідними правилами. Вірусологічні лабораторії (відділи) мають достатній арсенал методів, щоб швидко (експрес-метод) розпізнати вірус або його антигени безпосередньо в патологічному матеріалі (наприклад, вірус сказу в мазках з головного мозку). Широкого застосування набули молекулярно-генетичні методи виявлення вірусів, зокрема ПЛР. Проте досить часто спочатку здійснюють виділення збудника на клітинній культурі, пташиному ембріоні, що розвивається, чи шляхом зараження чутливих видів лабораторних тварин. У таких випадках дослідження може тривати кілька тижнів. Розроблено також ретроспективні методи діагностики, основані на виявленні відповідних антитіл у сироватці крові тварин, що перехворіли.
Діагностуючи вірусну хворобу, слід мати на увазі можливість персистенції ряду вірусів в організмі тварини, які можуть бути непричетні до хвороби, а також можливість змішаної вірус-вірусної чи вірусо-бактеріальної інфекції.
Запитання для самоконтролю: 1. Назвіть основні відмінності вірусів від бактерій. 2. Опишіть механізм репродукції вірусів. 3. Дайте визначення поняттю «тропізм вірусів». 4. Опишіть механізм патогенної дії вірусу на організм тварини. 5. Назвіть основні методи детекції вірусу в досліджуваному матеріалі.
До змісту