Ознайомлення зі схемами проведення основних серологічних реакцій

Серологічні реакції. Методи виявлення антитіл у сироватці крові тварин або людини (ретроспективна діагностика) і методи виявлення антигенів із застосуванням відомих сироваток (індикація збудника) дістали назву серологічних реакцій, які характеризуються високою чутливістю і специфічністю. Ці реакції — реальний прояв взаємодії між антигеном і антитілом. Залежно від характеру прояву такої взаємодії антитіла поділяють на коагулюючі (аглютиніни, преципітини), лізуючі (бактеріолізини, гемолізини), нейтралізуючі (антитоксини, віруснейтралізуючі антитіла).
Виявлення у сироватці крові або інших рідинах організму специфічних антитіл до певного патогенного мікроорганізму свідчить про інфікування тварини (раннє або після перенесеної хвороби), а в деяких випадках — про наявність імунітету. Серологічні реакції широко використовують у діагностиці більшості інфекційних хвороб тварин. Особливого значення набуває серологічна діагностика хронічних і латентних інфекцій, при яких виділення та індикація збудника утруднені.
Реакція аглютинації (РА) та її модифікації. У реакції аглютинації беруть участь антитіла (аглютиніни) та антиген (аглютиноген). Суть РА полягає у взаємодії антитіла з антигеном, внаслідок чого відбувається склеювання бактерій з утворенням пластівців, які видно неозброєним оком. У вірусології використовують реакцію гемаглютинації (РГА), яка ґрунтується на властивостях деяких вірусів склеювати еритроцити барана. Реакція є неспецифічною. Щоб вона стала специфічною, додають позитивну сироватку і склеювання гальмується. Ця реакція дістала назву реакції затримки гемаглютинації (РЗГА).
Реакція преципітації (РП). Існують різні методи постановки РП. Найвідомішою є реакція кільцепреципітації (реакція Асколі), яку використовують для виявлення сибіркового антигену у тваринній сировині (шкіра, шматочки внутрішніх органів, м’язи). Антиген отримують шляхом екстрагування у фізіологічному розчині гарячим або холодним способом. Отриманий антиген нашаровують тонкою скляною піпеткою на преципітувальну сироватку або підшаровують сироватку під антиген у вузьких пробірках. Якщо результат позитивний, то через кілька хвилин на межі дотику антигену і антитіла з’являється преципітат, який нагадує сіро-біле кільце або диск. Є кілька модифікацій РП, які ставлять в агаровому гелі, де антиген і антитіло дифундують назустріч одне одному, утворюючи білі лінії преципітації.
Реакція нейтралізації (РН) ґрунтується на властивостях імунної сироватки при додаванні до відповідного вірусу блокувати його здатність до репродукції в чутливій біологічній системі. Здатність імунної сироватки інактивувати інфекційну активність вірусу є наслідком взаємодії нейтралізуючих антитіл з певними антигенними детермінантами поверхневих вірусних білків. У лабораторній діагностиці вірусних інфекцій як чутливих систем використовують культури клітин, організми сприйнятливих тварин і курячі ембріони.
Реакція зв’язування комплементу (РЗК). У РЗК беруть участь дві системи — бактеріолітична та індикаторна (специфічна і гемолітична). Перша складається з антигену й антитіл (один відомий, інший ні). До другої системи входять еритроцити барана (антиген) і відповідна гемолітична сироватка (антитіла). РЗК проводять у два прийоми: спочатку з’єднують з досліджуваною сироваткою крові, де шукають антитіла, а потім додають комплемент. За відсутності в сироватці антитіл імунний комплекс не утворюється і комплемент лишається вільним. Оскільки процес адсорбції комплементу комплексом для звичайного ока невидимий, то для виявлення цього процесу додають гемсистему. Реакцію визначають так. Якщо у першій баксистемі комплемент зв’язався, то при додаванні гемсистеми гемоліз еритроцитів не відбувається і реакція вважається позитивною. Якщо ж комплемент у першій системі не зв’язався через відсутність антитіл, то він зв’яжеться з гемсистемою, у результаті чого відбудеться гемоліз еритроцитів і реакція вважатиметься негативною.
Реакція тривалого зв’язування комплементу (РТЗК). Це варіант звичайної РЗК з тією відмінністю, що перша фаза реакції відбувається впродовж 16 – 18 год на холоді (4 С). За таких умов у першій системі в комплексі антиген — антитіло додатково зв’язуються і кріофільні (холодові) антитіла, що підвищує чутливість реакції.
Імуноферментний і радіоімунний аналізи (ІФА і РІА). В ІФА і РІА використовують методи, що ґрунтуються на застосуванні ферментного маркера або маркера, міченого нуклідом, фіксованого на антитілах (Ат) або антигенах (Аг), наявність яких дає змогу виявити реакцію Аг – Ат. Перший відомий компонент реакції (антитіла або антиген) сорбують на тверду фазу (ТФ). Наступні компоненти, включаючи досліджувані проби, вносять послідовно (поетапно) у рідкому розчиненому вигляді й інкубують. Імунні комплекси антиген — антитіло відділяють від компонентів реакції, які не прореагували при відмиванні ТФ (твердої фази). На кінцевому етапі в ІФА і РІА використовують противірусні або антивидові антитіла (чи антигени), мічені відповідно ферментом або радіонуклідом.
Результати ІФА оцінюють за допомогою приладів (ридерів) за оптичним поглинанням або візуально за інтенсивністю забарвлення хромогену, а результати РІА — за допомогою лічильників радіоактивності (гамма-лічильників). У лабораторії можна проводити до 10000 проб-аналізів за добу.
Опсоніни та опсонофагоцитарна реакція. Опсоніни — антитіла, які полегшують макрофагам фагоцитоз бактерій. Дія опсонінів змінює електричний потенціал поверхні бактерійних клітин і робить їх більш доступними для захоплення й перетравлювання фагоцитами. Опсоніни виявляють і в імунних, і в нормальних сироватках крові, однак їх вміст у крові неімунних тварин є незначним.
Відмиті від плазми лейкоцити крові втрачають здатність до фагоцитозу. Додавання імунної сироватки відновлює цю властивість, причому інтенсивність відновленого фагоцитозу залежить від вмісту антитіл у доданій сироватці. Це дає змогу порівнювати активність сироваток і навіть діагностувати окремі хвороби із застосуванням опсонофагоцитарної реакції.

Практична частина

Реакція преципітації (РП). Досліджують проби шкіри на сибірку. Проби попередньо стерилізують в автоклаві.
Компоненти реакції: шматочок шкіри подрібнюють, 1 г отриманої маси вміщують у пробірку, заливають 10 мл фізіологічного розчину і кип’ятять упродовж 30 – 40 хв на водяній бані (гарячий спосіб). Інший варіант: 1 г подрібненої шкіри розтирають у ступці з піском, заливають 0,3%-м карболізованим фізрозчином (1 : 10) і настоюють (екстрагують) упродовж 16 – 18 год за кімнатної температури (холодовий спосіб). Екстракт, який може містити сибірковий антиген (преципітиноген), фільтрують крізь вату до досягнення повної прозорості. Інший компонент — виготовлена біофабричним способом преципітувальна сибіркова сироватка. Перед постановкою реакції її фільтрують.
Постановка реакції. У спеціальні преципітаційні пробірки піпеткою з поділками наливають по 0,2 – 0,3 мл преципітувальної сироватки. Потім пастерівською піпеткою обережно, по стінці пробірки нашаровують на сироватку досліджуваний екстракт у такій самій кількості (метод нашарування). При використанні методу нашарування в пробірки наливають досліджуваний екстракт, а потім, зануривши пастерівську піпетку до дна пробірки, підшаровують під нього преципітувальну сироватку.
Реакцію вважають позитивною, якщо впродовж перших 15 хв з моменту її постановки на межі контакту екстракту і сироватки утворюється сірувато-біле кільце. Якщо це кільце недостатньо різко виражене, реакцію оцінюють як сумнівну, а за відсутності кільця — як негативну.
Безпосередньо перед постановкою реакції ставлять контролі з її компонентами: 1) сибірковий антиген (біофабричного виробництва) + преципітувальна сироватка — реакція має бути позитивною; 2) сибірковий антиген + нормальна сироватка коня — реакція має бути негативною; 3) фізрозчин + преципітувальна сироватка — реакція має бути негативною.
Реакція аглютинації (РА). Досліджують сироватки крові тварин на бруцельоз.
Компоненти реакції: проби сироваток крові, універсальний бруцельозний антиген для РА, РЗК та РТЗК, кольоровий бруцельозний антиген для роз бенгал проби, позитивна бруцельозна і негативна сироватки; фенолізований (0,5%-й) фізіологічний розчин.
Пластинкова реакція аглютинації з бруцельозним роз бенгал антигеном (РБП). Реакцію ставлять на чистих сухих емальованих пластинках з ямками за температури 18 – 30 °С. За допомогою шприца-напівавтомата або мікропіпетки на дно ямок вносять до 0,03 мл досліджуваних сироваток. Потім у кожну ямку добавляють по 0,03 мл кольорового антигену. При дослідженні сироваток крові овець, кіз, буйволів і північних оленів достатньо 0,015 мл антигену. Антиген і сироватки ретельно перемішують, розподіляючи отриману однорідну суміш по всій поверхні ямки. Пластинку обережно погойдують. Облік реакції проводять упродовж 4 хв після змішування сироваток з антигеном. За наявності вираженої аглютинації пофарбованих бруцел антигену, що виявляється в утворенні рожевих пластівців, реакцію вважають позитивною, а за відсутності аглютинації (суміш залишається рівномірно забарвленою) — негативною.
Перед постановкою РБП ставлять контроль антигену з негативною та позитивною бруцельозними сироватками і контроль антигену на прояв спонтанної (неспецифічної) аглютинації: до 0,03 мл антигену добавляють 0,03 мл фізіологічного розчину.
Класичний (пробірковий) метод РА. Реакцію з сироватками крові великої рогатої худоби проводять в об’ємі 1 мл у розбавляннях 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200 і 1 : 400. Контролі — з негативною сироваткою в ідентичних розбавляннях і з позитивною бруцельозною сироваткою до її максимального титру.
Для дослідження кожної сироватки потрібно 5 пробірок. У першу з них вносять 0,1 мл сироватки і добавляють 2,4 мл фізрозчину (основне розбавляння 1 : 25). У третю, четверту і п’яту пробірки вносять по 0,5 мл фізрозчину. Потім з першої пробірки переносять у другу і третю по 0,5 мл основного розбавляння сироватки. Після змішування 0,5 мл вмісту третьої пробірки переносять у четверту, так само — з четвертої в п’яту, після чого з п’ятої пробірки видаляють 0,5 мл отриманої суміші. Потім у другу, третю, четверту і п’яту пробірки добавляють по 0,5 мл антигену, розбавленого фізіологічним розчином у співвідношенні 1:10. Таким чином отримують необхідні розбавляння сироватки. В першу пробірку антиген не вносять (контроль якості сироватки). Сироватки розливають мікропіпеткою (з грушею), а при проведенні масових досліджень — дозаторами.
Штатив з пробірками обережно струшують, вміщують на 16 – 20 год у термостат при 37 – 38 °С, потім упродовж 1 год витримують за кімнатної температури і проводять облік реакції.
Облік починають з контролів. Хід реакції нормальний, якщо в контролі з негативною сироваткою отримано негативний результат, а з позитивною бруцельозною сироваткою — позитивний. Результати реакції визначають хрестиками («плюсами»). Чотири хрестики («плюси») (++++) — повне прояснення рідини та наявність яскраво вираженого осаду у вигляді парасольки. Під час струшування пробірки парасолька розпадається на пластівці й грудочки, а рідина залишається прозорою (аглютинація 100 %). Три «плюси» (+++) — неповне прояснення рідини і добре виражена парасолька (аглютинація 75 %). Два «плюси» (++) — слабке прояснення рідини й помірно виражена парасолька (аглютинація 50 %). Один хрестик (+) — ледь помітне прояснення рідини, парасолька виражена слабко (аглютинація 25 %). «Мінус» (–) — прояснення немає, парасолька не утворилася, на дні пробірки видно осад у вигляді крапки, при легкому струшуванні пробірки утворюється рівномірна суспензія.
Титром антитіл вважають останнє розбавляння сироватки, в якому відбулася аглютинація не менш ніж на два хрестики. У великої рогатої худоби бруцельоз вважають установленим при позитивній РА в титрі 1 : 200 і вище, тобто за наявності в 1 мл сироватки не менш як 200 МО антитіл.
Реакція зв’язування комплементу (РЗК). Компоненти реакції: досліджувана і контрольні (негативна й позитивна бруцельозна) сироватки крові великої рогатої худоби; антиген бруцельозний, універсальний для РА, РЗК та РТЗК в робочому титрі, вказаному підприємством-виробником; комплемент — свіжа, консервована або суха сироватка крові морської свинки; гемолітична сироватка (гемолізин) у подвійному титрі, вказаному виробником; еритроцити барана — 2,5%-ва (від осаду) суспензія у фізіологічному розчині; фізіологічний розчин. У день постановки реакції досліджувану й контрольну сироватки інактивують на водяній бані при 60 – 62 °С упродовж 30 хв.
Перед постановкою головного досліду проводять титрування комплементу в гемолітичній і бактеріолітичній системах. Періодично (один раз на три місяці та кожну нову серію) титрують комплемент і гемолізин.
Титрування гемолізину. Спочатку готують основне розбавляння гемолізину — 1 : 100 (0,1 мл гемолізину + 9,9 мл фізрозчину). Потім з основного готують розбавляння 1 : 500; 1 : 1000, …, 1 : 4000.
У пробірки вносять по 0,2 мл кожного розбавляння гемолізину і додають по 0,2 мл комплементу в розбавлянні 1 : 20, по 0,2 мл 2,5%-ї суспензії еритроцитів, по 0,4 мл фізрозчину. Пробірки струшують, ставлять на водяну баню при 37 – 38 °С на 10 хв і потім враховують результат. Титр гемолізину — це його найменша кількість, необхідна для повного гемолізу впродовж 10 хв 0,2 мл суспензії еритроцитів за наявності 0,2 мл комплементу, розбавленого 1 : 20. Робочий титр має бути вдвічі вищим.
Титрування комплементу в гемолітичній системі. Комплемент у розбавлянні 1 : 20 розливають у пробірки в дозах від 0,02 до 0,2 мл з інтервалами по 0,02 мл. В кожну пробірку додають фізрозчин до об’єму 0,2 мл. Потім в усі пробірки вносять по 0,2 мл гемолізину в подвійному титрі та по 0,2 мл 2,5%-ї суспензії еритроцитів. Наступний етап — добавляння фізрозчину по 0,4 мл. Після струшування пробірки на 10 хв вміщують на водяну баню при 37 – 38 °С і враховують результат. Титр комплементу — його мінімальна кількість, що спричинює повний гемоліз еритроцитів.
Титрування комплементу в бактеріолітичній системі дає змогу кінцево визначити дозу комплементу для системи з досліджуваною сироваткою та антигеном. Використовують інактивовані позитивну бруцельозну та негативну сироватки. Їх розбавляють фізрозчином 1 : 5 і розливають по 0,2 мл в кожну (2 ряди по 10 пробірок). Потім у пробірки кожного ряду вносять комплемент, розбавлений 1 : 20, в наростаючих дозах: від 0,02 до 0,2 мл з інтервалом 0,02 мл. Об’єм рідини в пробірках доливають фізіологічним розчином до 0,2 мл. Після розливання комплементу в перший ряд пробірок із кожною сироваткою вносять по 0,2 мл антигену в робочому розбавлянні, в другий ряд — по 0,2 мл фізрозчину. Пробірки струшують і на 20 хв ставлять на водяну баню. Потім в усі пробірки добавляють по 0,4 мл гемолітичної системи (0,2 мл гемолізину в робочому титрі і 0,2 мл 2,5%-ї суспензії еритроцитів) і знову ставлять на 20 хв на водяну баню при 37 – 38 °С. Після цього проводять облік результатів. Титр комплементу в бактеріолітичній системі — його мінімальна кількість, яка спричинює повний гемоліз суспензії еритроцитів у пробірках з негативною сироваткою без антигену при затримці гемолізу в пробірках з позитивною сироваткою та антигеном.
Проведення головного досліду. Сироватку досліджують у розбавляннях 1 : 5 та 1 : 10 з антигеном і 1 : 5 без антигену (контроль). Реакцію проводять в об’ємі 0,2 мл у визначеному робочому титрі (розбавлянні). Контролі головного досліду: негативна і позитивна бруцельозна сироватки в розбавляннях 1 : 5 та 1 : 10 з антигеном і 1 : 5 без антигену; гемолітична система (гемолізин та еритроцити — по 0,2 мл і фізрозчин — 0,6 мл).
Після внесення компонентів бактеріологічної системи (сироватка + антиген + комплемент) пробірки упродовж 20 хв витримують на водяній бані. Потім розливають компоненти гемолітичної системи і знову пробірки на 20 хв вміщують на водяну баню. Результати реакції враховують через 3 – 4 год після виймання штативів з водяної бані та оцінюють у хрестиках: «++++» — відсутність гемолізу; «+++» — гемоліз 25 % еритроцитів; «++» — гемоліз 50 % еритроцитів; «+» — гемоліз 75 % еритроцитів; «–» («мінус») — повний гемоліз еритроцитів, відсутність осаду, інтенсивне забарвлення рідини гемоглобіном. Реакцію визнають позитивною при затриманні гемолізу на 2 – 4 хрестики в одному або двох розбавляннях досліджуваної сироватки і сумнівною — при затриманні гемолізу з оцінкою в один хрестик. При отриманні сумнівного результату сироватки крові від таких тварин досліджують повторно через 15 – 30 днів. Якщо сумнівну РЗК отримано двічі, вважають, що тварини реагують позитивно.

Запитання для самоконтролю: 1. Визначте серологічні реакції, участь у яких беруть коагулюючі антитіла. 2. Визначте серологічні реакції, участь у яких беруть лізуючі антитіла. 3. Розкрийте суть опсонофагоцитарної реакції. 4. Назвіть відмінність між РЗК та РТЗК.