Лабораторна робота № 2

Прості живильні середовища — м’ясо-пептонний бульйон і агар — готують на м’ясній воді.
М’ясна вода. М’ясо звільняють від кісток, жиру, плівок і сухожилків, пропускають через м’ясорубку, заливають 2- чи 4-кратною кількістю води (за масою) і кип’ятять упродовж 1 год.
Рідину фільтрують крізь вату, полотнину, потім крізь фільтрувальний папір. Об’єм фільтрату вимірюють і доливають до вихідного об’єму дистильованою водою.
Інший спосіб: м’ясний фарш заливають 2- чи 4-кратною кількістю дистильованої води, ретельно перемішують і залишають на добу в прохолодному місці. Наступного дня фарш віджимають, настій кип’ятять упродовж 30 хв і фільтрують.
Приготовлену м’ясну воду розливають у пляшки й стерилізують упродовж 30 – 40 хв в автоклаві при тиску 100 кПа (1 атм).
М’ясо-пептонний бульйон (МПБ). До м’ясної води додають 1 % пептону, 0,5 % хімічно чистої кухонної солі і кип’ятять до розчинення пептону. Потім у гарячому бульйоні визначають рН і добавлянням 10%-го розчину питної соди (гідрокарбонату натрію) чи децинормального розчину їдкого натру встановлюють рН = 7,2 – 7,4. Після цього бульйон ще раз кип’ятять упродовж 15 – 20 хв і фільтрують крізь подвійний паперовий фільтр. Готовий бульйон розливають у пробірки й колби, стерилізують упродовж 15 – 20 хв в автоклаві при тиску 100 кПа (1 атм).
М’ясо-пептонний агар (МПА). У м’ясо-пептонний бульйон добавляють 2 3 % агар-агару і розплавляють його нагріванням в автоклаві. У розплавленому агарі визначають рН і встановлюють його таким, що дорівнює 7,2 – 7,4 добавлянням 10%-го розчину питної соди чи децинормального розчину їдкого натру. Для прояснення середовища на 1 л розплавленого й охолодженого до 50 °С агару добавляють білок одного курячого яйця, після чого нагрівають суміш в автоклаві за температури 105 °С для зсідання білка, фільтрують у гарячому вигляді крізь ватно-марлевий фільтр (у нагрітому автоклаві), розливають у колби й пробірки, потім стерилізують в автоклаві за тиску 100 кПа (1 атм) упродовж 30 хв.
Сухі живильні середовища. У лабораторній практиці широко використовують готові сухі живильні середовища, що випускаються промисловістю. Їх розчиняють у дистильованій воді, розливають у пробірки чи колби, бактеріологічні чашки і за потреби стерилізують в автоклаві.
Розлив живильних середовищ. Середовища розливають у пробірки й колби за допомогою пристосування, що складається зі штатива і скляної лійки, на кінці якої закріплена гумова трубка зі скляним наконечником. З цією ж метою використовують спеціальні дозувальні пристрої — дозатори.
Лабораторна апаратура і правила користування нею. Дрібні організми і предмети, невидимі неозброєним оком, розглядають і вивчають за допомогою оптичного приладу — мікроскопа. Для біологічних досліджень вітчизняною промисловістю вироблені такі мікроскопи: «Біолам Р» — мікроскоп біологічний робочий з моно- чи бінокулярною насадками, збільшення від 50 до 1800 разів; «Біолам Д» — мікроскоп біологічний дорожній; «Біолам С» — мікроскоп біологічний студентський; «Люмам Р» — робочий і «Люмам Д» — дослідницький люмінесцентні мікроскопи.

Кожний мікроскоп має дві основні системи: механічну й оптичну (мал. 8). Механічна система мікроскопа складається зі штатива, що включає ніжку 1 і тубусотримач 3 чи колонку. До неї прикріплений тубус 5 з обертовим барабаном-револьвером 7 на нижньому кінці. Тубус переміщується макрометричним гвинтом 11, для тонкого наведення призначений мікрометричний гвинт 2. До ніжки прикріплений предметний столик 8, на який поміщають досліджуваний препарат, що закріплюється затискачами.
Оптична система складається з дзеркала 10, конденсора 9 з ірисовою діафрагмою, об’єктивів 6 і окуляра 4. Збільшення об’єктивів зазначене на їхній оправі: 8, 10, 20, 40, 60, 90. Розрізняють два типи об’єктивів: сухі та імерсійні (олійні). Під час роботи з імерсійними об’єктивами краплю олії (кедрової чи рицинової) наносять на мазок і за допомогою макрометричного гвинта обережно, під контролем ока занурюють об’єктив в олію, не торкаючись скла. Спостерігаючи в окуляр, повільно піднімають макрогвинтом тубус до появи зображення. Для тонкого наведення використовують мікрометричний гвинт. Окуляри вітчизняних мікроскопів позначають 7, 10, 15, 20, тобто цифрами, що вказують на ступінь їхнього власного збільшення. Помноживши цифру на оправі об’єктива на цифру окуляра, отримують число, що показує, у скільки разів збільшує мікроскоп.
Перед роботою з мікроскопом потрібно встановити освітлення. При денному світлі користуються плоским дзеркалом, при штучному освітленні — увігнутим. Як джерела штучного світла використовують лампи-освітлювачі. Коли світло встановлене, препарат поміщають на предметний столик і вивчають спочатку за малого, а потім за великого збільшення, використовуючи для цього суху чи імерсійну систему.
Люмінесцентні мікроскопи використовують для вивчення об’єктів, що мають власне світіння, чи об’єктів із вторинним світінням, що виникає після обробки їх спеціальними фарбами — флуорохромами (акридин, аурамін, флуоресцеїн та ін.). Використовують також люмінесцентні антитіла — специфічні гамма-глобуліни, виділені з гіперімунних сироваток, оброблені барвниками. Під час фарбування мазків такі «мічені» антитіла адсорбуються на поверхні антигену (мікробної клітини), що виявляється при дослідженні в люмінесцентному мікроскопі у вигляді яскравого світіння.
Крім звичайних світлових мікроскопів у науково-дослідній роботі та для діагностичних цілей застосовують електронні мікроскопи, у яких замість світлових променів використовують потік електронів, що рухаються.
Способи й апаратура для стерилізації. Автоклав (мал. 9) призначений для стерилізації водяною парою під тиском. Він являє собою масивний металевий казан 12, що вкритий зовні кожухом 13 і герметичне закривається кришкою 15. Усередині зовнішнього казана знаходиться другий казан меншого діаметра 14. Між ними є вільний простір, куди надходить пара з пароутворювача 8 через патрубок 17. Пароутворювач має лійку 1 з кранами й водомірним склом 9, за яким визначають рівень води. При підігріванні автоклава утворюється пара, що крізь отвір 11 у дні внутрішнього казана потрапляє у внутрішній простір, де розміщують предмети, які стерилізують. Коли закривають випускний кран 16, пара, що утворилася, піднімає тиск і температуру. За підвищенням тиску стежать за показаннями манометра 2. Щоб уникнути розриву автоклава, передбачено запобіжний клапан 10, що автоматично відкривається чи закривається залежно від сили тиску в апаратурі. У нижній частині автоклава влаштовано кран 16 для випускання пари й води після роботи.

До роботи з автоклавом допускають тільки осіб, що вивчили інструкцію і склали іспит з техніки безпеки. Робота з автоклавом потребує суворого виконання встановлених правил і визначеної послідовності.
Контроль за роботою автоклава здійснюють за допомогою речовин, що плавляться за певної температури (бензонафтол — при 110 °С, бензойна кислота — при 120 °С). У пробірку з однією з цих речовин вносять фуксин або сафранін, щільно закривають і закладають її в автоклав. Якщо температура досягне рівня, що відповідає температурі плавлення цієї речовини, то вона розплавиться й зафарбується. В автоклаві стерилізують предмети, що не псуються і не змінюються за температури понад 100 °С.
Сушильну шафу (піч Пастера) застосовують для стерилізації сухим жаром. Це металева шафа з подвійними стінками, обкладена всередині азбестом. Нагрівання здійснюють електрикою чи газовим пальником. Стерилізують у сушильній шафі пробірки, пастерівські піпетки, бактеріологічні чашки, колби та інший скляний посуд. Скляні предмети загортають у папір. Час обробки — 2 год при 150 °С або 1 год при 160 °С. Про достатній ступінь стерилізації свідчить пожовтіння ватяних пробок і паперу.
Фільтрувальні прилади використовують для очищення рідини від бактерій і грибів, а також для отримання вірусів у чистому вигляді, оскільки вони на відміну від бактерій проходять крізь бактеріальні фільтри. Для фільтрації застосовують азбестоцелюлозні й мембранні фільтри з певними розмірами пор. Фільтри закріплюють між металевими пластинками у фільтротримачах (системи Зейтця, Сальникова та ін.). Рідини фільтрують під підвищеним або зниженим тиском, який створюють за допомогою насосів. Перед роботою фільтри в змонтованому вигляді стерилізують, а після роботи — знищують, металеві частини стерилізують автоклавуванням.
Центрифуги — прилади, дія яких ґрунтується на відцентрових силах. За їх допомогою відокремлюють часточки, різні за щільністю, від рідини. Вони бувають ручними чи електричними, що складаються з електродвигуна, осі, на якій закріплений ротор для центрифужних чи скляних пробірок. Кількість обертів регулюють за допомогою реостата. Перед початком роботи потрібно зрівноважити центрифужні пробірки на центрифужних вагах, добавляючи воду чи ту рідину, яку центрифугують (можна шматочки вати чи паперу, які вкладають у стаканчики). Стаканчики з пробірками вставляють у гнізда, розміщені один проти одного. Кришку щільно закривають і фіксують гвинтами чи затискачами. Вмикають струм і поступово збільшують число обертів. Відкривати кришку центрифуги дозволяється тільки після її повної зупинки.
Холодильники використовують для тривалого зберігання мікробних культур, біопрепаратів, а в деяких випадках — досліджуваного патологічного матеріалу. Бактеріальні культури зберігають за температури 4 °С, вірусовмісний матеріал — у замороженому вигляді. Температура регулюється спеціальним пристроєм. Усередину холодильника вміщують термометр, його показання щодня записують у листі контролю роботи приладу.
Запитання для самоконтролю:
  1. Опишіть будову прокаріотної мікробної клітини.
  2. Розкажіть про капсуло- та спороутворення у мікроорганізмів.
  3. Які ферменти мікробів ви знаєте і яке вони мають практичне значення?
  4. Опишіть будову мікроскопа і правила роботи з ним.
  5. Наведіть сучасні живильні середовища і методики їх приготування.
До змісту